什么是熒光定量PCR、數(shù)字PCR�
| 一、技�(shù)� |
在全球醫(yī)療器械行�(yè)中，體外診斷是占比最高的�(xì)分領(lǐng)域之一，根�(jù)診斷原理的不同，體外診斷�(chǎn)品分為分子診�、免疫診�、生化診斷等多種類型。其中，分子診斷的靈敏度、特異�、準(zhǔn)確性等均較為突出，尤其是在新冠肺炎疫情全球蔓延的大背景�，以PCR為代表的分子診斷技�(shù)得到了加速發(fā)��
PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的英文縮寫，是一種以DNA雙鏈�(fù)制原理為基礎(chǔ)，對(duì)特定核酸樣本�(jìn)行體外擴(kuò)增的生物技�(shù)，能�?qū)⑽⒘康暮怂針颖狙杆倏截愔翈装偃f(wàn)�，便于后�(xù)的分析研�。該技�(shù)源起�20世紀(jì)70�80年代，經(jīng)�(guò)幾十年的�(fā)�，經(jīng)歷了初代傳統(tǒng)PCR、第二代熒光定量PCR和第三代�(shù)字PCR的演變，在醫(yī)療篩查診�、生命科�(xué)基礎(chǔ)研究、法�(yī)分析鑒定及食品衛(wèi)生和�(huán)境檢�(cè)等方面得到廣泛應(yīng)��
1.熒光定量PCR
�(shí)�(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR�技�(shù)，簡(jiǎn)稱qPCR,是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物�(zhì)（熒光染料或熒光�(biāo)記的特異性探針），利用熒光信�(hào)積累�(shí)�(shí)�(jiān)�(cè)整�(gè)PCR�(jìn)程，后通過(guò)�(biāo)�(zhǔn)曲線�(duì)未知模板�(jìn)行定量分析的方法�
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與普通PCR相比，實(shí)�(shí)熒光定量PCR技�(shù)是一次由定性技�(shù)向定量技�(shù)的飛�。運(yùn)用該�(xiàng)技�(shù)，可以對(duì)DNA、RNA樣品�(jìn)行相�(duì)定量、定量和定性分��
（圖：熒光定量PCR�(shí)�(yàn)�(guò)程） |
2.�(shù)字PCR
�(shù)字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一種核酸分子絕�(duì)定量技�(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的�(gè)�(shù)，是�(duì)起始樣品的絕�(duì)定量。PCR�(shí)際上是一�(gè)在模板DNA、引�(模板片段兩端的已知序�)和四種脫氧核苷酸等存在的情況�，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)，擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)��
（圖：數(shù)字PCR技�(shù)原理� |
根據(jù)微反�(yīng)單元的不同形式，�(shù)字PCR�(chǎn)品可分為微板�、微滴式和芯片式等。目�，市�(chǎng)上主要的�(shù)字PCR�(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片��
三代核酸檢測(cè)技�(shù)�(duì)比：
技�(shù)方法 | 概念 | 技�(shù)�(yōu)�(shì) | 技�(shù)劣勢(shì) |
傳統(tǒng)PCR | 采用普通PCR�(kuò)增儀�(kuò)增靶基因，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)�(chǎn)物�(jìn)行定性分� | 1.可實(shí)�(xiàn)特定核酸片段的體外復(fù)� | 1.相關(guān)核酸染料�(duì)操作人員和環(huán)境具有危� 2.易出�(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)� 3.耗時(shí)�(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)� 4.�(wú)法準(zhǔn)確定� |
熒光定量PCR | 是一種在DNA�(kuò)增反�(yīng)�，以熒光化學(xué)物質(zhì)�(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循�(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)�(nèi)參或者外參法�(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列�(jìn)行定量分�� | 1.污染�(fēng)�(xiǎn)� 2.操作流程更簡(jiǎn)單、經(jīng)�(jì)高效 3.樣品加樣量少 | 1.不同廠家生產(chǎn)的試劑和�(shè)備之間的差異�(duì)檢測(cè)�(jié)果影響較�，不具備可比� 2.存在背景值的影響，結(jié)果易�(chǎn)生偏� 3.低拷貝的DNA難以檢測(cè) 4.受PCR抑制物的影響較大 |
�(shù)字PCR | 將核酸樣品分配到大量�(dú)�、平行的微反�(yīng)單元（納升級(jí)）中，部分反�(yīng)單元包含靶標(biāo)分子（陽(yáng)性），而其他不包含（陰性），接著�(jìn)行擴(kuò)�，并利用TaqMan化學(xué)試劑或染料標(biāo)記探針檢�(cè)靶標(biāo)序列，能�?qū)崿F(xiàn)靶標(biāo)分子的絕�(duì)�(jì)�(shù)� | 1.特異性強(qiáng)、靈敏度� 2.絕對(duì)定量，準(zhǔn)確性好 3.抗干擾能力強(qiáng) | 1.特異性強(qiáng)、靈敏度� 2.絕對(duì)定量，準(zhǔn)確性好 3.抗干擾能力強(qiáng) |
| 一、光�(xué)原理解決方案� |
1.熒光定量PCR
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| （圖：熒光定量PCR光路圖） | |
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| （圖：熒光定量PCR光譜� |
解決方案一�
| 熒光通道 | 激�(fā)波長(zhǎng) | �(fā)射波�(zhǎng) | 二向色鏡 | 技�(shù)參數(shù) | ||
| Atto425 | Ex 430/10 | Em 480/10 | \ | �(shè)�(jì)波段 | 300-1100nm@OD6 | |
| FAM | Ex 470/10 | Em 515/10 | \ | 中心波長(zhǎng)誤差 | ±2nm | |
| HEX | Ex 535/10 | Em 565/10 | \ | 半帶� | 10±2nm | |
| ROX | Ex 585/10 | Em 614/10 | \ | �(shí)�(xiàn)方式 | 單片 / 膠合 | |
| CY5 | Ex 630/10 | Em 670/10 | \ | 鍍膜工藝 | 磁控濺射 / 真空鍍膜 | |
| CY5.5 | Ex 682/10 | Em 725/10 | \ | 峰值透過(guò)� | >85% | |
解決方案二：
| 熒光通道 | 激�(fā)波長(zhǎng) | �(fā)射波�(zhǎng) | 二向色鏡 | 技�(shù)參數(shù) | ||
| FAM | Ex 470/30 | Em 520/20 | 505二向色鏡 | �(shè)�(jì)波段 | 300-1100nm@OD6 | |
| HEX | Ex 530/20 | Em 565/20 | 550二向色鏡 | 中心波長(zhǎng)誤差 | ±3nm | |
| ROX | Ex 570/20 | Em 615/20 | 590二向色鏡 | 半帶� | 30±3nm�20±2nm | |
| CY5 | Ex 630/20 | Em 675/20 | 647二向色鏡 | �(shí)�(xiàn)方式 | 單片 / 膠合 | |
| 鍍膜工藝 | 磁控濺射 / 真空鍍膜 | |||||
| 峰值透過(guò)� | >90% | |||||
2.�(shù)字PCR
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| （圖：數(shù)字PCR光路圖） | （圖：數(shù)字PCR光譜� |
解決方案�
| 熒光通道 | 激�(fā)波長(zhǎng) | �(fā)射波�(zhǎng) | 二向色鏡 | 技�(shù)參數(shù) | ||
| FAM | Ex 488/20 | Em 527/20 | 505二向色鏡 | �(shè)�(jì)波段 | 300-1100nm@OD6 | |
| HEX | Ex 527/20 | Em 567/15 | 550二向色鏡 | 中心波長(zhǎng)誤差 | ±2nm | |
| ROX | Ex 572/28 | Em 615/24 | 590二向色鏡 | 半帶� | 20±2nm | |
| CY5 | Ex 625/26 | Em 661/11 | 647二向色鏡 | �(shí)�(xiàn)方式 | 單片 / 膠合 | |
| 鍍膜工藝 | 磁控濺射 / 真空鍍膜 | |||||
| 峰值透過(guò)� | >90% | |||||