生物顯微鏡與光學(xué)濾光�
生物顯微鏡與光學(xué)濾光� （此文章為轉(zhuǎn)載）
（圖源網(wǎng)�(luò)，侵刪）
一、暗視野顯微�
(一) 原理和結(jié)�(gòu)特點(diǎn)
在日常生活中，室�(nèi)飛揚(yáng)的微?；覊m是不易被看見�，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射�(jìn)來，灰塵便粒?？梢娏耍@是光�(xué)上的丁達(dá)爾現(xiàn)�。暗視野顯微鏡就是利用此原理�(shè)�(jì)的。它的結(jié)�(gòu)特點(diǎn)主要是使用中央遮光板或暗視野聚光�，常用的是拋物面聚光器，使光源的中央光束被阻擋．不能由下而上地通過�(biāo)本�(jìn)入物�。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的�(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡�(nèi)，因而整�(gè)視野是黑暗的�
在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像．并非物體的本身，所以只能看到物體的存在和運(yùn)�(dòng)，不能辨清物體的�(xì)微結(jié)�(gòu)。但被檢物體為非均質(zhì)�(shí)，并大于1�2波長(zhǎng)，則各級(jí)衍射光線同時(shí)�(jìn)入物�，在某種程度上可觀察物體的�(gòu)�。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的�(xì)微結(jié)�(gòu)，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運(yùn)�(dòng)，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特�，可用以觀察活�(xì)胞的�(jié)�(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運(yùn)�(dòng)等�
(�) 制作中央遮光�
普通顯微鏡只要聚光器是可以拆卸�，支架的口徑適于安裝暗視野聚光器，即可改裝成暗視野顯微鏡。在無暗視野聚光器時(shí)，可用厚黑紙片制作一�(gè)中央遮光�，放在普通顯微鏡的聚光器下方的濾光片框上，也能得到暗視野效果�
1．將顯微鏡聚光器�(diào)到最高位�，用低倍鏡�(duì)好焦距�
2．取下目�，從鏡筒中觀察并�(diào)節(jié)光闌的大�，使其與鏡筒中所見物鏡的視野相等�
3．用厚黑紙剪制中央擋光板。外圈直徑與濾光片框架相�，中央部分的大小與調(diào)節(jié)好的光闌孔徑一�(可用半透明的小紙片，放在通光孔處聚光鏡鏡面上，紙上顯示的光斑即為光闌的孔徑，再用圓規(guī)量取大小)�
4．將中央擋光板放在濾光片框架�，開大光闌�(jìn)行樣品觀��
如需使用高倍鏡作暗視野觀察，�(yīng)按高倍鏡�(duì)焦后的視野大小重新制作中央擋光板�
保存好各自制作的中央遮光�，以便在后面的實(shí)�(yàn)中使��
（三）使用方�
1．把暗視野聚光器裝在顯微鏡的聚光器支架上�
2．選用強(qiáng)的光�，但又要防止直射光線�(jìn)入物鏡，所以一般用顯微鏡燈照明�
3．在聚光器和�(biāo)本片之間要加一滴香柏油，目的是不使照明光線于聚光鏡上面�(jìn)行全反射，達(dá)不到被檢物體，而得不到暗視野照��
4．升降集光器，將集光鏡的焦點(diǎn)�(duì)�(zhǔn)被檢物體，即以圓錐光束的頂點(diǎn)照射被檢�。如果聚光器能水平移�(dòng)并附有中心調(diào)節(jié)裝置，則�(yīng)首先�(jìn)行中心調(diào)節(jié)，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴(yán)格位于一直線��
5．選用與聚光器相�(yīng)的物�，調(diào)節(jié)焦距 操作方法與普通顯微鏡相同，找到所需觀察的物像�
（四）觀� 觀察示教臺(tái)上暗視野顯微鏡下的活�(xì)�。在黑暗的背景里，可見細(xì)�、細(xì)胞核和細(xì)胞器的衍射光圖像�
�、相差顯微鏡
(一) 原理和結(jié)�(gòu)特點(diǎn)
光波有振幅（亮度）、波�(zhǎng)（顏色）及相�(指在某一�(shí)間上光的波動(dòng)所能達(dá)到的位置)的不�。當(dāng)光通過物體�(shí)，如波長(zhǎng)和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色�(biāo)本的道理。而活�(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)�，因�(xì)胞各部微�(xì)�(jié)�(gòu)的折射率和厚度略有不�，光波通過�(shí)，波�(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變�，僅相位有變�(相應(yīng)�(fā)生的差異即相�)，而這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉�(xiàn)象，把相差變成振幅差(明暗�)，同�(shí)它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活�(xì)胞或未染色標(biāo)��
相差顯微�(�2-3)與普通顯微鏡的主要不同之處是：用�(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡(通常�(biāo)有PH的標(biāo)�)代替普通物�，并帶有一�(gè)合軸用的望遠(yuǎn)�。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出�。相板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位�。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以�，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。調(diào)軸望�(yuǎn)鏡是用來�(jìn)行合鈾調(diào)節(jié)�。相差顯微鏡在使用時(shí)，聚光鏡下面�(huán)f狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線�，必需�(diào)節(jié)光闌的亮�(huán)和相板的�(huán)狀圈重合對(duì)齊，才能�(fā)揮相差顯微鏡的效�。否則直射光或衍射光的光路紊亂，�(yīng)被吸收的光不能吸�，該推遲相位的光波不能推�，就失去了相差顯微鏡的作��
(�)使用方法 相差裝置為多功能系列顯微鏡中的附屬裝置．與普通顯微鏡配合使用�
1．相差裝置的�(diào)換安� 卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將�(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上�，它可吸收紅色和�(lán)色光，使波長(zhǎng)范圍小的單色光線�(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉(zhuǎn)換器上旋下普通物�，換上相差物��
2．調(diào)� 打開光源，旋�(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)�，將“o”�(duì)�(zhǔn)�(biāo)示孔，使普通聚光器部分�(jìn)入光�。先使用低倍相差物�，按普通顯微鏡操作方法�(jìn)行對(duì)光和�(diào)焦� 旋轉(zhuǎn)�(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應(yīng)，如相差物鏡�40 x�(shí)�(yīng)用x40�(biāo)示孔的光闌�
3．合鈾調(diào)� 拔出目鏡，插入合鈾望�(yuǎn)�，一邊從望遠(yuǎn)鏡內(nèi)�(nèi)觀察，并用左手固定其外�；一邊用右手�(zhuǎn)�(dòng)望遠(yuǎn)鏡內(nèi)筒使其下�，當(dāng)�(duì)�(zhǔn)焦點(diǎn)就能看到�(huán)狀光闌的亮�(huán)和相板的黑環(huán)，此�(shí)可將望遠(yuǎn)鏡固定住。再升降集光器并�(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與黑環(huán)一�，然后左右前后調(diào)節(jié)�(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)�，使兩環(huán)完全重合＜圖2—4，如亮環(huán)比黑�(huán)小而位于內(nèi)�(cè)�(shí)，應(yīng)降低集光器使亮環(huán)放大；反之，則應(yīng)升高聚光�，使亮環(huán)縮小。如若升到最高限度仍不能完全重合，則可能是載玻片過厚之故，應(yīng)更換。合抽調(diào)整完畢，抽出望遠(yuǎn)�，換回目�，按常規(guī)要領(lǐng)�(jìn)行觀�。在更換不同倍率的相差物鏡時(shí)，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌和重新合抽調(diào)�。使用油鏡時(shí)，集光器上透鏡表面與載玻片之間要同�(shí)加上香伯��
(�)觀� 在相差顯微鏡下觀察活�(xì)胞，可清楚地分辨�(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞核、核仁以及胞�(zhì)中存在的顆粒狀�(jié)�(gòu)�
�、熒光顯微鏡
(一)原理和結(jié)�(gòu)特點(diǎn)
熒光顯微鏡是利用一�(gè)高發(fā)光效率的�(diǎn)光源，經(jīng)過濾色系�(tǒng)�(fā)出一定波�(zhǎng)的光(如紫外光3650入或紫藍(lán)�4200�)作為激�(fā)光、激�(fā)�(biāo)本內(nèi)的熒光物�(zhì)�(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大�(jìn)行觀�。這樣在強(qiáng)烈的�(duì)襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)�(gòu)和功能以及化�(xué)成分等的研究� 熒光顯微鏡的基本�(gòu)造是由普通光�(xué)顯微鏡加上一些附�(如熒光光源、激�(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片�)的基�(chǔ)上組成的。熒光光源一般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波�(zhǎng)的光，但每種熒光物質(zhì)都有一�(gè)�(chǎn)生最�(qiáng)熒光的激�(fā)光波�(zhǎng)，所以需加用激�(fā)濾片（一般有紫外、紫�、藍(lán)色和綠色激�(fā)濾片�，僅使一定波�(zhǎng)的激�(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收�。每種物�(zhì)被激�(fā)光照射后，在極短�(shí)間內(nèi)�(fā)射出較照射波�(zhǎng)更長(zhǎng)的可見熒�。熒光具有專一�，一般都比激�(fā)光弱，為能觀察到專一的熒�，在物鏡后面需加阻�(或壓�)濾光�。它的作用有二：一是吸收和阻擋激�(fā)光�(jìn)入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛?二是選擇并讓特異的熒光透過，表�(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用�
熒光顯微鏡就其光路來分有兩種�
1．透射式熒光顯微鏡 激�(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激�(fā)熒光�(�2—5)。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激�(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上．這是比較舊式的熒光顯微鏡。其�(yōu)�(diǎn)是低倍鏡�(shí)熒光�(qiáng)，而缺�(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱．所以對(duì)觀察較大的�(biāo)本材料較��
2．落射式熒光顯微� 這是近代�(fā)展起來的新式熒光顯微�，與上不同處是激�(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表�，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物�(�2-6)。光路中需加上一�(gè)雙色束分離器，它與光鈾呈45。角，激�(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所�(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激�(fā)光同�(shí)�(jìn)入物�，反回到雙色束分離器，使激�(fā)光和熒光分開，殘余激�(fā)光再被阻斷濾片吸�。如換用不同的激�(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插�，可滿足不同熒光反應(yīng)�(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)�(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)�
（二）使用方法．
1．打開燈�，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能�(dá)到最亮點(diǎn)�
2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激�(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相�(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激�(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插��
3．用低倍鏡觀�，根�(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的�(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中�，使其位于整�(gè)照明光斑的中央�
4．放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀�� 使用中應(yīng)注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須用無熒�
特殊油鏡；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需�(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)�，影響汞燈壽��
(�)觀� 在示教臺(tái)上的熒光顯微鏡下用藍(lán)紫光濾光�，可見經(jīng)o�01％的丫啶橙熒光染料染色的�(xì)胞，�(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激�(fā)�(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅�)�